Metabolismo del DNA

Nelle cellule di qualunque essere vivente l'integrità del genoma è continuamente minacciata da fattori interni ed esterni. Dai radicali liberi del metabolismo alle radiazioni, dalle sostanze chimiche ai raggi UV, sono innumerevoli gli agenti in grado di danneggiare il DNA. La maggior parte delle lesioni è però rapidamente neutralizzata da un efficiente sistema che rileva e ripara il danno prima che possa trasmettersi alle cellule figlie. Cosa succede se questo meccanismo smette di funzionare correttamente? La cellula non riesce più a rispondere alle lesioni e inevitabilmente accumula mutazioni. Le conseguenze sono drammatiche: la morte cellulare oppure la trasformazione in cellula tumorale.

Molti dei protagonisti della risposta al danno al DNA (DDR,DNA Damage Response) sono noti da decenni perché associati a sindromi genetiche che predispongono al cancro. È la loro funzione biochimica ad essere per lo più sconosciuta. Il programma di ricerca IFOM Metabolismo del DNA diretto da Vincenzo Costanzo, punta a decifrare il ruolo di queste proteine attraverso un approccio pionieristico: osservarle in azione per capire i processi in cui sono coinvolte. Integrando microscopia elettronica a studi di biochimica e di metabolomica in vitro, Costanzo ha potuto visualizzare "all'opera" alcune proteine chiave della DDR deducendone così la funzione.

Il requisito fondamentale affinché una cellula possa duplicarsi e propagare il proprio DNA nelle cellule figlie è che il suo genoma resti stabile nelle generazioni. Per far fronte ai costanti attacchi che mettono in pericolo la stabilità del DNA, le cellule hanno evoluto una varietà di meccanismi da mettere in atto in risposta alle diverse tipologie di lesione. Parallelamente all'attivazione dei meccanismi per la riparazione del danno, la cellula reagisce bloccando il ciclo cellulare o, nei casi più gravi, con la morte programmata. Anche se ancora ignoto esiste un meccanismo che coordina riparazione, arresto e apoptosi, tre fenomeni che devono essere perfettamente orchestrati all'interno della cellula per garantire la miglior risposta possibile per l'organismo.

Tale regolazione avviene a molteplici livelli attraverso l'interazione tra un enorme numero di molecole. Come studiare dunque processi così complessi che coinvolgono proteine, DNA, RNA, nucleotidi, acidi grassi e altri piccoli composti chimici presenti nella cellula? Di tutto ciò si occupa la metabolomica, una nuova disciplina che analizza l'intero set di molecole che prende parte a un processo. Ad oggi sono state identificate oltre cinquanta proteine coinvolte nella DDR classificate in tre categorie: sensori, mediatori ed effettori. In presenza di un danno al DNA si attivano i sensori, molecole "sentinella" che rilevano la lesione e, attraverso una complessa staffetta tra i mediatori, trasmettono l'informazione fino agli effettori, le proteine che riparano il danno. Gli stessi sensori allertano anche i checkpoint cellulari: dei veri posti di blocco situati in specifici punti del ciclo cellulare per controllare che la cellula abbia completato correttamente la fase precedente prima di permettere il transito alla successiva. In caso di danno il checkpoint rallenta o arresta il ciclo cellulare fino all'avvenuta riparazione.

Da oltre dieci anni Vincenzo Costanzo è impegnato nello studio dei meccanismi che controllano il metabolismo del DNA nei vertebrati fornendo un significativo contributo a questo campo d'indagine. Alla fine degli anni '90 aveva messo a punto una tecnica innovativa per ripercorrere in vitro le diverse fasi della DDR che lo ha portato alla scoperta di un nuovo checkpoint di danno al DNA in grado di prevenire l'inizio della replicazione (Costanzo et al., Mol Cell 2000). La stessa strategia è stata in seguito impiegata con successo da Costanzo e da altri ricercatori per studiare il ruolo di proteine coinvolte nel ciclo cellulare, nella replicazione e nella risposta alle lesioni del DNA.

Il programma Metabolismo del DNA ha accolto una delle più grandi sfide della ricerca biomedica: studiare il ruolo di proteine essenziali coinvolte nella stabilità del genoma e nel metabolismo del DNA. Essenziale è una proteina la cui alterazione è letale per la cellula o l'organismo in cui avviene. Questa è la ragione per cui le proteine essenziali sono così difficili da studiare: non si possono analizzare con la genetica classica, rimuovendole dalla cellula e indagandone il fenotipo risultante, proprio perché senza di esse la cellula non può esistere. Molte delle proteine che regolano la DDR sono essenziali e, sorprendentemente, lo sono anche in assenza di apparenti danni al DNA, suggerendo che possano essere coinvolte anche in altri meccanismi di base indispensabili per la vita della cellula, come il metabolismo, la replicazione e il ciclo cellulare.

Comprendere a livello molecolare come avviene il coordinamento tra attivazione dei checkpoint, replicazione del DNA e riparazione dei danni è uno degli obiettivi specifici portati avanti da Costanzo attraverso la metabolomica. Accanto a questo, un altro filone di ricerca più focalizzato verso le applicazioni cliniche punta a individuare ulteriori bersagli molecolari della via di segnalazione accesa dalla DDR che possano essere utilizzati anche a scopi terapeutici. Il fine ultimo sarà la caratterizzazione di nuovi composti chimici in grado di modulare in maniera specifica la DDR e la riparazione dei danni. Questi studi contribuiranno a stabilire la funzione biologica di geni implicati in processi essenziali per la cellula che risultano invece alterati in cancro.

Multidisciplinare, innovativo e trasversale. Queste le caratteristiche dell'approccio di Costanzo allo studio delle dinamiche che regolano la stabilità del genoma e il metabolismo del DNA nei vertebrati. Multidisciplinare perché si basa sull'utilizzo di un ampio ventaglio di tecnologie, dall'imaging alla proteomica, dalla biochimica in vitro su estratti cellulari allo studioin vivodi patologie umane. È innovativo per l'impiego di metodiche all'avanguardia come la metabolomica, la microscopia elettronica e l'atomic force microscopy per studiare e visualizzare le molecole coinvolte nei processi di danno e riparazione del DNA. E infine è trasversale perché partendo dall'analisi di proteine implicate in meccanismi biologici fondamentali per la vita della cellula perviene a conoscenze che interessano molteplici aree di indagine apparentemente lontane.

Fil rouge del suo intero percorso di ricerca è lo Xenopus laevis, un anfibio dalle caratteristiche uniche che lo rendono un organismo modello ideale per lo studio di processi biologici essenziali nei vertebrati. Utilizzando l'estratto di oocita fertilizzato in vitro è possibile infatti ripercorrere in provetta le prime dodici divisioni embrionali dello Xenopus e studiare così tutte le tappe del ciclo cellulare. La sensazionale novità introdotta Costanzo è l'aggiunta di frammenti di DNA all'estratto fertilizzato: il DNA esogeno è riconosciuto dal sistema come "danneggiato" e nel giro di pochi minuti si assiste alla completa attivazione della DDR in vitro. Questo sistema inoltre è interamente manipolabile e permette facilmente di rimuovere specifiche proteine dall'estratto per studiare come i processi di DDR e riparazione dei danni avvengono in loro assenza. È stata proprio questa strategia a consentire a Costanzo di comprendere la funzione biochimica delle proteine essenziali coinvolte nella stabilità del genoma.

La stragrande maggioranza delle proteine coinvolte nella DDR è implicata anche in sindromi genetiche dai sintomi estremamente diversi ma accumunate da un'unica caratteristica: l'elevata suscettibilità all'insorgenza dei tumori. Ad esempio BRCA-1 e BRCA-2, due proteine che intervengono come mediatori ed effettori nella DDR, sono mutate nella sindrome da cancro ereditario alla mammella e all'ovaio, una patologia caratterizzata dall'aumentato rischio di sviluppare in giovane età tumori al seno e alle ovaie.  Un altro esempio è l'atassia telangectasia, una gravissima forma di atassia cerebellare associata a immunodeficienza, provocata da mutazioni in ATM, una proteina sentinella indispensabile per attivare la DDR. Anche in questo caso si registra nei pazienti un considerevole incremento dell'insorgenza dei tumori.

È proprio l'atassia telangectasia, secondo Vincenzo Costanzo, la malattia che ricapitola l'intera patologia umana. Polisintomatica, racchiude in sé una grande varietà di manifestazioni, dalla neurodegenerazione all'invecchiamento precoce, dal diabete alla predisposizione al cancro. Fenomeni che possono essere compresi solo indagando a livello molecolare gli effetti delle mutazioni di ATM. Importanti contributi in questo campo giungono infatti dagli studi di metabolomica portati avanti da Costanzo: dopo aver identificato nel 2010 due nuovi target molecolari di ATM (Smith et al., Nat Cell Biol 2009; Balestrini et al., Nat Cell Biol 2010), l'anno successivo ha dimostrato che la stessa proteina controlla alcune fasi fondamentali del metabolismo cellulare evidenziando per la prima volta il collegamento tra riparazione dei danni al DNA e metabolismo (Cosentino et al.,EMBO J 2011).

La stretta associazione tra danno al DNA e insorgenza del cancro non è però l'unica ragione che lega l'oncologia allo studio della DDR. Le terapie più diffuse per curare il cancro, ovvero la chemio- e radioterapia, si basano proprio sull'induzione di estese lesioni al DNA nelle cellule in attiva proliferazione, tra cui quelle tumorali. Una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano la risposta cellulare al danno permetterà di sfruttare al meglio i chemioterapici massimizzando l'effetto distruttivo sulle cellule cancerogene e riducendo allo stesso tempo gli effetti collaterali sugli altri tessuti. 

Costanzo V, Robertson K, Ying CY, Kim E, Avvedimento E, Gottesman M, Grieco D, Gautier J, Reconstitution of an ATM-dependent checkpoint that inhibits chromosomal DNA replication following DNA damage, Mol Cell 2000.

Smith E, Dejsuphong D, Balestrini A, Hampel M, Lenz C, Takeda S, Vindigni A, Costanzo V, An ATM- and ATR-dependent checkpoint inactivates spindle assembly by targeting CEP63, Nat Cell Biol  2009.

Balestrini A, Cosentino C, Errico A, Garner E, Costanzo V, GEMC1 is a TopBP1-interacting protein required for chromosomal DNA replication, Nat Cell Biol 2010.

Cosentino C, Grieco D, Costanzo V, ATM activates the pentose phosphate pathway promoting anti-oxidant defence and DNA repair, EMBO J 2011.